Personalmente, no creo que BQSR tenga un gran impacto en las llamadas variantes, pero no es necesario que adivines. Si ejecuta GATK BQSR, genera una tabla y gráficos de exactamente cuánto se ajustan los puntajes de calidad. El ajuste variará dependiendo de la posición en el contexto de lectura y genómico (base anterior y siguiente). En mi experiencia, la diferencia es de unos pocos puntos como máximo, pero ciertamente es notable.

GATK recomienda BQSR para los datos del genoma y del exoma, que normalmente es mucho mayor que 15x.

Esa es una buena pregunta.

Yo diría que no necesita preocuparse por la recalibración de variantes para

• un número bajo de muestras (p. ej., solo dos tríos); No pude hacer que la recalibración de GTAK de las puntuaciones de las variantes funcionara de todos modos
• muestras de alta cobertura (p. Ej., X Ten genomas con cobertura 30x) donde las muestras de ADN son de alta calidad comparable y se han secuenciado con tecnología.

En general, tengo la impresión de que muchos de los pensamientos y modelos estadísticos avanzados integrados en GATK provienen de las fases anteriores del proyecto 1000 Genomes. Esto significa (1) cobertura baja, (2) genomas de cobertura diferente (3) secuenciados con diferentes versiones de tecnología mediante (4) muestras diferentes y (5) secuenciación de poblaciones.

Si se encuentra en un entorno clínico donde realiza una secuenciación 30x en plataformas X Ten de todos modos, entonces la recalibración de variantes probablemente no le ayudará mucho.

Por otro lado, si está integrando muchos conjuntos de datos de diferentes centros de datos y versiones de máquinas, etc. ., la recalibración de variantes puede valer la pena.

Una buena comprobación sería observar las distribuciones de calidad del genotipo y otras métricas relacionadas con la variante / calidad antes y después de la recalibración.

Cualquiera: corrija yo si me equivoco!

Idealmente, estos métodos BQSR se hicieron teniendo en cuenta cómo los errores técnicos realmente arruinarán las llamadas de calidad base y cuando las máquinas estaban aún más en la fase de desarrollo mientras se usaban para el proyecto 1000G. A partir de ahora, las máquinas son más potentes y fuertes donde es poco probable que las usemos, pero aún las usamos con SNP listados para encontrar las covariables y construir un modelo alrededor de los datos usando la información con trucos de aprendizaje automático para mejorar la calidad de esas llamadas base. . Idealmente, debería ser más apropiado cuando se utilizan máquinas antiguas de Illumina u otras compañías estándar, pero con máquinas nuevas que son mucho más potentes y tienen un alto rendimiento, deberían tender a fallar. No recuerdo si se han realizado tales pruebas, pero obviamente sé que las nuevas máquinas de secuenciación siempre hacen tales pruebas para mostrar que han reducido tales errores, pero aún recomiendan tales BQSR para llamadas de variantes. Ahora el problema es la lista de SNP, este para mí es el problema real ya que la lista que usamos está lejos de ser el estándar de oro y si eso no se atiende adecuadamente, todo lo que inferimos sobre la calidad sigue siendo inestable. Este enlace es bastante informativo, pero es antiguo. Realmente vería mejoras con nuevos secuenciadores. Sin embargo, a mucha menos gente le importan estas pruebas en la investigación académica y el laboratorio traslacional realmente no invertirá tiempo y dinero en ellas, a menos que la instalación tenga algunos bioinformáticos que siempre realicen dichas pruebas mientras compran un nuevo secuenciador para el instituto. En términos de genómica clínica para encontrar variantes, creo que deberían usarse los secuenciadores más potentes y actualizados, pero no estoy seguro de si todavía usan BQSR y, de ser así, cuál es la lista que usan para construir el modelo de covariación en torno a los datos.

En caso de que BQSR no sea una opción (es decir, organismos no modelo), sería mejor utilizar alguna secuencia de control interno como PhiX para la plataforma illumina. Aunque se supone que esto es una práctica común, algunas instalaciones lo ignoran. En principio, las máquinas deberían utilizar estas secuencias como referencia para que la puntuación sea más precisa. En mi experiencia, las primeras 10-15 bases de las lecturas de illumina siempre tuvieron una calidad inferior. Esto se puede ver fácilmente en las distribuciones de nucleótidos. Yo recomendaría recortar las primeras 10-15 bases y recortar los extremos según la calidad. Si la calidad de las lecturas individuales es importante, como la resecuenciación de baja cobertura o las aplicaciones de ensamblaje de genoma de novo.