Pregunta:
¿Cómo puedo mejorar el rendimiento de las ejecuciones de secuenciación de MinION?
gringer
2017-05-31 14:48:19 UTC
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Esta es una pregunta frecuente dentro de la comunidad de nanoporos. Oxford Nanopore afirma actualmente que puede generar rendimientos de ejecución de 10 a 15 gigabases (p. Ej., Consulte aquí y aquí) y, sin embargo, es más común ver usuarios que solo administran en el rango de 1-5 gigabase.

Entonces, ¿por qué la gran diferencia en el rendimiento?

Tres respuestas:
#1
+12
gringer
2017-05-31 15:02:35 UTC
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Asistí a una charla de Josh Quick en PoreCampAU 2017, en la que habló sobre algunas barreras comunes para obtener tanto un buen rendimiento de secuenciación como una larga duración de lectura. En su mayoría, se reduce a tener más cuidado con la preparación de la muestra. Tenga en cuenta que el MinION seguirá secuenciando una muestra sucia, solo tendrá un rendimiento reducido. Aquí están mis notas de esa charla:

  • Lo más difícil de la secuenciación de MinION es obtener la muestra en primer lugar
  • Hay muchos tipos de muestras y métodos de extracción diferentes
  • No puede obtener lecturas más largas que las que ingresó; la mierda en lleva a la mierda
  • El ADN es muy estable cuando no se mueve, pero muy sensible al daño lateral
  • El método de extracción de ADN con fenol cloroformo es muy bueno y se puede usar con un gel de fase bloqueada para facilitar la extracción
  • Una simple extracción con sal + alcohol podría ser el mejor método de extracción (porque implica la menor cantidad de trabajo en el ADN)
  • EDTA (por ejemplo, el que se encuentra en el tampón TE y muchos kits de extracción) no es compatible con el kit rápido
  • Las series de Nanopore más consistentemente buenas producidas por el laboratorio de Josh fueron las ejecuciones de ligaduras 1D en R9.4; la mejor ejecución en general fue una extracción de fenol-cloroformo + kit rápido
  • John Tyson puede desconectarse de un agujero de bajo rendimiento (a través del software)
  • Obtener pequeñas cantidades de lecturas cortas es muy importante
  • Técnicas de purificación sugeridas (y en su mayoría no probadas): columna de centrifugado (60-100kb); extracción de etanol (100-150 kb), diálisis (150-250 kb); tapón de agarosa de bajo punto de fusión (~ 1 Mb, extracción de ADN in situ)
  • La entrada del protocolo de nanoporos está en nanogramos, pero en realidad debe indicarse como molaridad; el kit espera una entrada de aproximadamente 0,2 pmol
  • Imágenes de moléculas atadas a la superficie de la membrana. Luego puede ver que la densidad de la celda de flujo es independiente de la longitud de la secuencia
  • Tapestation, Qubit y Nanodrop son una buena idea; una muestra de ADN que pueda pasar las tres pruebas funcionará bien: sin hombros de longitud corta por Tapestation, suficiente ADN por Qubit, alta pureza por Nanodrop
  • El ARN puede interferir con la secuenciación; Se recomienda digerir el ARN
  • Congelar el ADN es una muy mala idea. Los cristales de hielo son muy buenos para cortar el ADN en trozos pequeños
  • El ADN que se guarda en el refrigerador es notablemente estable; se puede conservar durante más de dos años (y probablemente indefinidamente)

Actualización sobre el rendimiento:

Realizamos una ejecución en junio de 2018 que produjo alrededor de 3 millones de lecturas de PCR- ADNc de ratón amplificado (lea N50 de ~ 1 kb), y eso fue en una situación en la que fue la primera muestra preparada por alguien, la cantidad de ADN de entrada fue probablemente alrededor del 20% de lo que debería haber sido, y sufrimos un incidente de pérdida de datos . Si eso es lo que sucedió con una mala ejecución, tengo grandes esperanzas para nuestras ejecuciones en el futuro.

Nuestra próxima ejecución de ADNc en agosto de 2018 produjo alrededor de 7 millones de lecturas y una lectura similar N50 (es decir, un rendimiento total de aproximadamente 7 Gb). La ejecución fue interrumpida por una actualización de Windows durante la primera noche (había deshabilitado las actualizaciones automáticas anteriormente, pero se habían vuelto a habilitar), y desde entonces ha habido actualizaciones de software y hardware adicionales para mejorar el rendimiento de la secuenciación. Si tenemos una buena celda de flujo y una preparación de muestras similar, espero que la próxima ejecución de cDNA que hagamos produzca más de 8 millones de lecturas, y posiblemente más de 10 millones.

#2
+2
roblanf
2017-06-10 08:52:26 UTC
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Mi apuesta es que la gente de nanopore (¡por supuesto!) ha realizado una gran cantidad de optimización en dos cosas clave:

  1. La limpieza del ADN
  2. La biblioteca se prepara

Creo que para la mayoría de las extracciones de ADN las limpiezas pueden variar mucho, pero algo como Blue Pippin hará un trabajo excepcional si tienes acceso a uno y puedes usarlo (no funcionarán para fragmentos de ADN SUPER largos que, por supuesto, no pueden moverse a través de un gel). El Blue Pippin también hace su selección de tamaño, por lo que no quema los poros secuenciando muchas cosas pequeñas. Esto también debería ayudar al rendimiento.

Entonces todo se reduce a la preparación de la biblioteca, y la respuesta de @ gringer tiene algunos buenos consejos al respecto.

#3
+1
Saidi Rahina Hussain
2018-10-27 01:28:34 UTC
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Estoy trabajando con un hongo y estoy usando el método CTAB para la extracción de ADN y utilicé un kit rápido para la preparación inicial de mi biblioteca, pero no funcionó y desde entonces he estado usando un kit de ligadura y me ha dado muy buenos resultados. . Logré obtener datos que van desde 4 GB a 13 GB.



Esta pregunta y respuesta fue traducida automáticamente del idioma inglés.El contenido original está disponible en stackexchange, a quien agradecemos la licencia cc by-sa 3.0 bajo la que se distribuye.
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