La primera mención del paradigma 30x que pude encontrar está en el artículo original de secuenciación del genoma completo de Illumina: Bentley, 2008. Específicamente, en la Figura 5, muestran que se han encontrado la mayoría de los SNP y que hay pocas bases descubiertas / sin llamar para cuando llega a 30x:

En estos días , 30x sigue siendo un estándar común, pero los proyectos de secuenciación de líneas germinales a gran escala a menudo se acercan más a 25x y lo encuentran adecuado. Cada grupo que hace esto en serio ha realizado cálculos de potencia basados ​​en detalles específicos de sus máquinas y preparación (¡cosas como las tasas de error y las longitudes de lectura son importantes!).

La genómica del cáncer va en la otra dirección. Cuando tiene que lidiar con la pureza, la ploidía y las poblaciones subclonales, se necesita mucha más cobertura que 30x. Nuestro grupo mostró en este artículo de 2015 que incluso la cobertura del genoma completo 300 veces superior de un tumor probablemente carecía de variantes raras reales en un tumor.

En general, la cobertura de secuencia que necesita realmente depende de las preguntas que esté haciendo, y recomendaría que cualquiera que diseñe un experimento de secuenciación consulte con un experto en secuenciación y un estadístico de antemano (y es ¡incluso mejor si son la misma persona!)

Solexa Inc. secuenció NA12878 chrX a ~ 30x a principios de 2007, que luego pasó a formar parte de Bentley (2008). Creo que esta fue la primera vez que apareció 30x. No recuerdo que tuvieran una razón particular para eso. La Figura 5 en el artículo publicado fue una secuela. Realmente no explica por qué no 25x o 35x, dado que las curvas entre 25x y 35x en esa figura son lineales.

En el resumen de Ajay et al (2011) , los autores argumentaron que "la recomendación actual de una cobertura de ~ 30x no es adecuada". No obstante, la sección de discusión parece sugerir que se necesitarían 50-60x con GAIIx, pero 35x fue adecuado con HiSeq2000 además de una mejor química reciente. En general, este documento proporciona un análisis más completo. La calidad de los datos en ese momento también está más cerca de los datos que producimos hoy.

La cobertura requerida está determinada en gran medida por dos factores: sesgo de ubicación de lectura (por ejemplo, sesgo de GC) y tasa de error de base / mapeo. Si bien el sesgo de GC se ha reducido con el protocolo sin PCR, la tasa de error base ha ido descendiendo desde HiSeq2500. Supongo que sería necesaria una cobertura de 30x si desea lograr la sensibilidad con los datos de 30x más antiguos. Illumina, como proveedor de servicios de secuenciación, y nuestra instalación de secuenciación aún insisten en el umbral de 30x.

La cobertura 30 veces mayor no es exclusiva de este problema, pero el número 30 tiene su papel empírico en las estadísticas:

En el análisis estadístico, la regla de tres establece que si un evento determinado no ocurrió en una muestra con n sujetos, el intervalo de 0 a 3 / n es un intervalo de confianza del 95% para la tasa de ocurrencias en la población. Cuando n es mayor que 30, esta es una buena aproximación a los resultados de pruebas más sensibles.

fuente: Wikipedia: Regla de tres (estadísticas)

De manera similar, puede buscar preguntas relacionadas como esta:

• ¿Cuál es la razón fundamental detrás del número mágico 30 en las estadísticas?

De acuerdo con esto, he visto procesamiento de datos en otras disciplinas que requerían n ≥ 30 para una confiabilidad suficiente de los resultados.

El punto que siempre pierdo en la discusión sobre la cobertura es que nadie dice cómo se calculó. ¿Se eliminaron los duplicados? ¿Cómo se cuentan las lecturas emparejadas superpuestas? ¿Como 2 o 1? Solo para señalar dos cosas que influyen en la cobertura.